研究植物自噬：挑战和推荐的方法

　　

　　

　　在植物中，自噬是一个保守的过程，通过这个过程，细胞内的物质，包括受损的蛋白质、聚集体和整个细胞器，被运输到液泡中进行降解，从而维持细胞的稳态。在过去的几十年里，人们对自噬机制的核心组成部分及其在植物生长发育中的生理作用以及对生物和非生物胁迫的反应进行了广泛的研究。此外，已经建立了几种监测植物自噬活动的方法，这些方法极大地促进了植物自噬的研究。然而，一些方法容易被误用或误解，有时使人怀疑所得出的关于植物自噬的结论的可靠性。本文综述了目前广泛应用于植物自噬监测的生理、微观和生化等方面的方法，并对其优缺点进行了讨论，以期为研究这一重要过程提供指导。

　　自噬是一种细胞内降解机制，它将细胞质成分隔离并传递给液泡或溶酶体进行分解(Zhuang等，2015;Michaeli et al. 2016;Marshall and Vierstra 2018)。自噬在真核生物中是进化保守的(Marshall and Vierstra 2018)。迄今为止，植物中已经描述了三种形式的自噬:微自噬、巨自噬和巨自噬(Marshall and Vierstra 2018)。巨噬(Macroautophagy，以下简称自噬)是植物自噬的主要形式(Qi et al. 2021)。在植物中，自噬主要由多种生物和非生物胁迫诱导，并在维持葡萄糖介导的根分生组织活性方面发挥重要作用(Huang et al. 2019a)。在植物自噬过程中，自噬底物如聚集的蛋白质或受损的细胞器被称为吞噬体的双膜开放式结构包围;吞噬体闭合形成双膜结合囊泡，称为自噬体。自噬体被运送到液泡中，在液泡中，它们的货物被驻留的水解酶降解(Bassham 2009;Floyd et al. 2012;Li and Vierstra 2012;庄等，2015;Michaeli et al. 2016;Marshall and Vierstra 2018;Qi et al. 2021)。

　　自噬机制由一组自噬相关(ATG)蛋白组成，这些蛋白在真核生物中具有进化保守性。自1997年第一个自噬相关基因ATG1被发现以来，已经在酵母(Saccharomyces cerevisiae)中鉴定了40多个ATGs (Matsuura et al. 1997;Fukuda and Kanki 2021)。随后，在植物中发现了许多酵母atg的同源物(Qi et al. 2021)。在植物中，这些ATGs形成了几种蛋白质复合物，包括ATG1-ATG13激酶复合物、III类磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)复合物、ATG9膜递送复合物、atg8 -磷脂酰乙醇胺(PE)和ATG5-ATG12偶联系统，以及n -乙基丙烯酰亚胺敏感因子附着蛋白受体(SNARE)复合物。这些复合物驱动自噬体形成并与液泡膜(液泡质体)融合，最终在液泡中降解(Li and Vierstra 2012)。

　　ATG8作为无活性前体合成，由ATG4蛋白酶处理以暴露c端甘氨酸残基;这种残留物在所有家庭成员中都是保守的(Marshall and Vierstra 2018)。由此产生的成熟和活化的ATG8结合到atp依赖的e1激活酶ATG7上，然后转移到e2偶联酶ATG3上，最后在ATG8特异性E3连接酶复合物的帮助下附着到脂质PE上，该复合物含有ATG5、ATG16和第二个泛素(Ub)折叠蛋白ATG12 (Li and Vierstra 2012)。同时，借助ATG7和ATG12特异性E2 ATG10, ATG12与ATG5偶联，形成ATG5 - ATG12偶联体系(Li and Vierstra 2012;Marshall and Vierstra 2018)。ATG12和ATG8加合物(在植物中或体外通过偶联反应合成)可以重组成脂质体，并经历电泳迁移率的变化，这很容易通过SDS-PAGE检测，然后用抗atg5或抗ATG8抗体进行免疫印迹(Thompson, et al. 2005;Phillips et al. 2008;Fujioka et al. 2008;Chung et al. 2010)。

　　ATG8-PE加合物包裹在膨胀的吞噬体上，并装饰自噬体的内外膜。最终，外膜上的ATG8-PE加合物被ATG4降解并释放再利用，而内膜上的ATG8-PE加合物在液泡中被活性水解酶降解(Yoshimoto et al. 2004)。利用共聚焦荧光显微镜和荧光蛋白(FP) -ATG8融合物，在H+- atp酶抑制剂concanamycin A (ConA)或半胱氨酸蛋白酶抑制剂E64d稳定后，可以检测到细胞质内的自噬体和液泡内的自噬体(Yoshimoto et al. 2004;contentto et al. 2005;Thompson et al. 2005;Izumi et al. 2015;Li et al. 2015)。

　　对拟南芥的遗传分析表明，大多数ATG敲除或敲低突变体在正常生长条件下表现出叶片过早衰老，对营养缺乏极度敏感(Doelling et al. 2002;Chung et al. 2010)，而表型通常与自噬活性受损相关。此外，这些突变体表现出对生物和非生物胁迫的耐受性改变以及不同的代谢组谱(Xiong et al. 2007;Hayward et al. 2009;Liu et al. 2009;Guiboileau et al. 2012;Avin - Wittenberg et al. 2015;Chen et al. 2015;Qi et al. 2021)。

　　通过自噬检测技术的发展，已经阐明了控制自噬的调控网络。越来越多的证据表明，在植物自噬体形成过程中，ATG蛋白的活性和稳定性受到翻译后修饰的强烈影响，特别是磷酸化、泛素化和过硫化。RAPAMYCIN靶蛋白(TARGET OF RAPAMYCIN, TOR)和蔗糖非发酵1相关激酶1 (SnRK1, SnRK1)在调节自噬中分别发挥负向和正向作用，可能是通过调节ATG1-ATG13激酶复合物和PI3K复合物核心组分的稳定性和活性(Liu and Bassham 2010;Chen et al. 2017a;Pu et al. 2017;Huang et al. 2019b)。此外，最近的研究表明，拟南芥(SINAT)的ring型E3 Ub连接酶蛋白家族7成员通过调节ATG1-ATG13和ATG6的蛋白水解来调节ATG1-ATG13和ATG6的稳定性，从而帮助调节自噬(Qi et al. 2017;2020;2022年)。最近，两个14-3-3适配器14-3-3 -3λ和14-3-3 -3κ与磷酸化的ATG13s特异性相关，被证明可以调节ATG1-ATG13复合物的形成，促进sinat介导的ATG13s蛋白水解，从而冗余调节自噬动力学(Qi et al. 2022b)。此外，信号分子硫化氢调节植物的基本过程，如自噬。在拟南芥中，ATG4和ATG18a的过硫化参与自噬，以响应环境线索，如脱落酸或诱导内质网(ER)应激的药物(Laureano-Marín et al. 2020;Aroca et al. 2021)。

　　近年来，利用分子遗传学、细胞生物学和生物化学方法揭示植物自噬的分子和功能机制取得了重大进展(Bassham 2015;Chen et al. 2017b;Marion et al. 2018)。目前已经开发了几种方法来检测植物细胞中的自噬，包括表型研究来分析正常生长条件下对氮或固定碳饥饿的耐受性和叶片衰老的发生;检测自噬体形成的细胞生物学方法;生化方法检测ATGs的积累。

　　然而，一些方法容易被误用或误解，这可能使人们对植物自噬结论的可靠性产生怀疑。在这篇综述中，我们总结了用于检测和量化植物自噬的技术，讨论了它们的优点和局限性，并强调了确保研究人员从这些方法中得出适当结论所需的注意事项。

　　在植物中，叶片衰老在正常生长条件下将衰老组织中的营养物质重新调动到年轻器官中，并循环养分以支持植物在营养限制下的生存(Masclaux-Daubresse 2016)。在自然叶片衰老过程中，自噬被诱导，并作为一种内务机制降解细胞内内容物并重新调动营养物质(Ishida et al. 2008;Wada et al. 2009;Izumi et al. 2017)。叶片衰老过程中发生的分解代谢反应很可能以叶绿体为目标进行降解，因为叶绿体在衰老的早期阶段被分解(Avila-Ospina et al. 2014)。在营养充足的条件下，大多数自噬缺陷突变体在种子萌发、子叶发育、根伸长和种子产生方面与野生型几乎没有区别(Hanaoka et al. 2002)。然而，atg突变体的莲座叶片较少，在长日照(16小时光照/8小时黑暗)或短日照(8小时光照/16小时黑暗)光周期下表现出早抽苔和早衰老(Doelling et al. 2002;Hanaoka et al. 2002;Chung et al. 2010;Li et al. 2014)。叶绿素含量较低，衰老相关基因如senescence 1 (SEN1)和YELLOW STRIPE LIKE 4 (YSL4)表达水平升高，证实了叶片早期衰老(Doelling et al. 2002)。这些结果表明，在整个植物生命周期中，自噬是维持细胞活力和有效利用营养物质所必需的。

　　在营养有限的条件下，自噬有助于回收受损或不需要的物质和细胞器，包括整个叶绿体，以补充必需的营养物质，并为细胞产生足够的资源，以支持其重要需求和生存(Masclaux-Daubresse et al. 2017;Qi et al. 2021;Yang et al. 2020a, b).在固定碳饥饿过程中，自噬通过不同的途径参与叶绿体基质和叶绿体蛋白的囊泡运输和降解(Ishida et al. 2008;Michaeli et al. 2014;Izumi et al. 2015)。叶绿体中不溶性淀粉颗粒的分解是植物夜间呼吸能量生产的关键步骤，因为它在叶肉细胞中产生可溶性糖(Smith and Stitt 2007)。一项利用烟叶的研究揭示了自噬对夜间淀粉颗粒降解的贡献(Wang et al. 2013)。总的来说，叶绿体成分的自噬降解可能是糖饥饿引起的。拟南芥中ATG基因的缺失破坏了自噬体的正常发育，导致对固定碳饥饿过敏(Doelling et al. 2002;Hanaoka et al. 2002;Thompson et al. 2005;Xiong et al. 2005;Suttangkakul et al. 2011;Li et al. 2014;Qi et al. 2021;Li et al. 2022)。当转入黑暗环境数天后，并在正常生长条件下恢复，土壤生长的atg突变体对黑暗处理表现出强烈的敏感性，其叶绿素含量和存活率较低(Hanaoka et al. 2002;Thompson et al. 2005;Chung et al. 2010;Qi et al. 2017;图1)。

　　图1

　　

　　土壤生长的atg10-1突变株对碳饥饿的敏感性增加。(a)土生野生型(WT)和atg10-1型植物对碳饥饿的敏感性。三周大的植株在正常光照/黑暗条件下生长(暗0天)，然后在持续黑暗条件下生长8天(暗8天)。然后让植物在正常的光/暗条件下恢复7天(恢复)，然后拍照。(b)和(c)碳饥饿处理8 d后植株叶绿素相对含量(b)和存活率(c)。星号表示与WT有显著差异(*P< 0.05;**经学生t检验P < 0.01)

　　由于使用土壤种植的植物进行固定碳饥饿测定耗时，研究人员设计了一种快速而可靠的测定方法，利用培养皿中琼脂培养基上生长的幼苗来测定固定碳限制的敏感性(Chung et al. 2010)。将幼苗转移到Murashige和Skoog (MS)琼脂培养基(不添加蔗糖)上，在连续的黑暗条件下培养数天，直到它们生长不良。在正常生长条件下(光照下)恢复后，与野生型幼苗相比，atg突变体的叶绿素含量和存活率下降(Chung et al. 2010;Suttangkakul et al. 2011;Li et al. 2014;Qi et al. 2017)。因此，在琼脂培养基上生长的幼苗和在土壤上生长的成年植株的碳饥饿处理都是分析固定碳限制耐受性的合适方法。

　　氮(N)是植物生长所需的最重要的营养物质之一。为了应对氮的限制，植物通过叶绿体降解途径回收叶肉细胞叶绿体中所含的氮，该途径部分依赖于自噬(Ren et al. 2014;Masclaux-Daubresse et al. 2017)。虽然固定碳和氮饥饿都会导致叶绿体自噬介导的降解，但这些条件下自噬的诱导可能通过不同的机制发生。与野生型植物相比，拟南芥atg突变体在氮素限制期间表现出更高的褪绿和更低的叶绿素含量(Doelling et al. 2002;Hanaoka et al. 2002;Thompson et al. 2005;Xiong et al. 2005;Qi et al. 2021;图2)然而，在长日照条件下，atg突变体对N饥饿的反应积累了更多的花青素，而在碳饥饿的植物中没有发现这种反应(Xiong et al. 2005;Qi et al. 2017)。肿瘤坏死因子受体相关因子1a (TRAF1a)和TRAF1b是通过调节植物中ATG6和ATG1?ATG13泛素化和降解来帮助调节自噬的衔接蛋白(Qi et al. 2017;2020)。TRAF1a和TRAF1b功能的丧失导致营养饥饿条件下自噬体形成减少(Qi et al. 2017)。事实上，与典型的自噬缺陷突变体atg10-1类似，traf1a和traf1b双突变体与野生型植物相比，对固定碳和氮饥饿都表现出更大的敏感性(Qi et al. 2017)。

　　图2

　　

　　Atg10-1突变体对氮饥饿的耐受性降低。(a)和(b)野生型(WT)和atg10-1对氮限制的表型响应。在MS培养基上生长1周的幼苗，转移到富氮(+ N)或无氮(-N)琼脂培养基上，5天后拍照。(c) (a)和(b)所示N +或N -条件下WT和atg10-1幼苗的相对叶绿素含量。N +条件下叶绿素含量设为100%。(** Student 's t检验P < 0.01)

　　因此，自噬在自然衰老过程中的营养循环和对营养限制的反应中起着重要作用。植物表型可以作为确定蛋白质在自噬中的功能的指南。在营养丰富和营养限制条件下，观察叶片衰老表型，计算叶片存活率和叶绿素含量是评估植物自噬活性的一种重要而简单的生理方法。当然，在得出特定基因功能的结论之前，这些表型分析应该用更直接的自噬测量来补充和证实。

　　2.2.1 有限公司的非聚焦显微镜分析GFP-ATG8e转基因植物

　　荧光显微镜可以检测与荧光蛋白融合的ATG蛋白的丰度，是研究植物细胞中自噬体动力学的可靠方法(Pu和Bassham 2016)。拟南芥基因组编码ATG8蛋白的9个亚型(ATG8a-ATG8i)，并在调节自噬活性方面部分发挥冗余作用(Doelling等人，2002;Sláviková et al. 2005)。自噬诱导后，ATG8前体被ATG4蛋白酶加工，暴露c端甘氨酸残基，并通过泛素样反应与膜脂PE结合共价修饰，促进ATG8 - PE加合物的形成(Ohsumi 2001;Yoshimoto et al. 2004;Hanada et al. 2007;Fujita et al. 2008)。尽管ATG8-PE同时修饰自噬体的内外膜，但在自噬过程中，ATG4蛋白酶介导的裂解可以去除外膜上的ATG8-PE。与液泡融合后，内膜相关的ATG8随单膜自噬体进入液泡，最终被驻留的水解酶降解(Li and Vierstra 2012;Slobodkin and Elazar 2013)。这些特性使ATG8成为植物细胞中监测自噬体和自噬体的有用标记物。

　　绿色荧光蛋白(GFP)与ATG8 (GFP-ATG8)的融合通常用于植物自噬体和自噬体的可视化(Li and Vierstra 2012;Liu and Bassham 2012)。值得注意的是，ATG8在被锚定到吞噬细胞膜之前，在其C端与PE结合，因此荧光蛋白只能添加到ATG8的N端(Yoshimoto et al. 2004;Woo et al. 2014)。编码融合蛋白的构建体GFP-ATG8可以稳定或短暂地导入拟南芥细胞，并且可以使用共聚焦显微镜检测融合蛋白(Yoshimoto et al. 2004;contentto et al. 2005;Thompson et al. 2005;Xiong et al. 2007;Klionsky et al. 2016)。在正常生长条件下的拟南芥根细胞中，大部分GFP-ATG8融合蛋白位于细胞质中，以弥散荧光信号的形式可见，有一些点状的自噬体通过细胞质流动移动(图3)。低水平的自噬主要发生在拟南芥根尖的分生组织区，或作为保家的基础自噬(Inoue et al. 2006;Chung et al. 2010;Huang et al. 2019a)。越来越多的证据表明，植物中gfp - atg8标记的点状结构的形成是在营养饥饿和几种生物和非生物胁迫下迅速诱导的(Liu et al. 2018;Qi et al. 2021)。

　　图3

　　

　　拟南芥根细胞自噬体的共聚焦显微镜检测。碳饥饿后转基因GFP-ATG8e幼苗的共聚焦显微镜观察。将1周龄的GFP-ATG8e幼苗单独转移到MS培养基(MS)或无蔗糖的MS液体培养基(c)或加concanamycin A (-C + ConA)中16 h，通过荧光共聚焦显微镜观察。标尺，50 μm

　　值得注意的是，由于自噬体在液泡中的酸水解会立即降解，因此必须使用抑制剂ConA，一种液泡H+- atp酶抑制剂，通过破坏液泡酸化和囊泡运输来阻止液泡介导的细胞内物质降解，通过共聚焦显微镜评估植物的自噬通量(Matsuoka et al. 1997;Dettmer et al. 2006)。事实上，当ConA处理稳定液泡时，在液泡中积累的自噬小体很容易被观察到为1-2 μm的液泡点(Marshall and Vierstra 2018;图3)。

　　通过计算每个镜框中gfp - atg8标记的自噬体的数量，并计算给定基因型或治疗下所有图像中自噬体的平均数量，可以定量评估自噬活性。每张图像中自噬体的平均数量表明自噬的程度(Yoshimoto et al. 2004;contentto et al. 2005;Thompson et al. 2005;Izumi et al. 2015;Li et al. 2015)。值得注意的是，GFP-ATG8在积累到高水平时形成点状蛋白聚集体;然而，这些聚集体通常是不均匀的形状，而不是球形的(Bassham 2015)。综上所述，在正常生长条件下，大多数GFP-ATG8信号弥散在细胞质中(图3)。转移到营养限制条件后，一些GFP-ATG8标记的点状结构主要存在于细胞质中，因为它们在液泡中会立即降解，但在与ConA孵卵后，它们作为自噬体在液泡中积累(图3)。

　　2.2.2 用于测量植物自噬的其他荧光标记蛋白

　　除ATG8外，其他自噬相关蛋白也定位于自噬小体和自噬相关结构。在营养限制条件下，ATG1、ATG13、ATG11、ATG6或ATG14与荧光蛋白的融合定位于细胞质中的点状结构，并在应用ConA后被传递到液泡中并在液泡中积累(Fujiki et al. 2007;Suttangkakul et al. 2011;Li et al. 2014)。对拟南芥悬浮细胞的研究表明，青色荧光蛋白(CFP)标记的ATG6和黄色荧光蛋白(YFP)-ATG8在细胞质内的点状结构中明显富集。当细胞在无蔗糖培养基中孵育时，荧光信号在亮灶中共定位(Fujiki et al. 2007)，提示ATG6与ATG8共定位。虽然ATG6的细胞内分布与拟南芥悬浮细胞中的高尔基体、反式高尔基网络(TGN)和内质网(ER)明显不同(Fujiki et al. 2007)，但值得注意的是，除了自噬外，ATG6在其他运输系统中也发挥着重要作用(harson - lowe and Olsen 2008;Patel and Dinesh-Kumar 2008)。

　　当在拟南芥叶片原生质体中短暂表达时，gfp标记的ATG1a和ATG13a通常被限制在细胞质中，聚集在与GFP-ATG8标记的点状结构大小相似的几个点状结构中(Suttangkakul et al. 2011)。然而，为了验证ATG1a和ATG13a是否标记自噬体或自噬体，需要测试ATG1a和ATG13a是否与ATG8a共定位。ATG11是ATG1 - ATG13复合物的核心成分，有助于将ATG1 - ATG13复合物连接到自噬膜上(Li et al. 2014)。在N饥饿和ConA处理下，GFP-ATG11在稳定的转基因拟南芥系根细胞液泡点状结构中与mCherry-ATG8a共定位并结合(Li et al. 2014)。这些结果表明，这些自噬体和自噬体结合蛋白可以作为自噬体标记物替代GFP-ATG8。

　　最近的研究表明，PI3K的一个新定义的关键成分ATG14参与了营养胁迫下的自噬体积累和货物输送(Liu et al. 2020)。对转基因GFP-ATG14b拟南芥根的共聚焦荧光显微镜分析显示，在氮饥饿条件下，在ConA处理下，GFP-ATG14b标记的点状结构与mCherry-ATG8a报告基因共定位，并在液泡中积累，表明ATG14在营养饥饿条件下易位到自噬体(Liu et al. 2020)。此外，本烟ATG14与YFP融合产生的点状信号与cfp - atg8标记的自噬结构和cfp - atg6标记的荧光点重叠(Wang et al. 2022a, b)，表明ATG14也是自噬分析的理想标记物。此外，紫外抗性相关基因(UVRAG)是烟叶中PI3K复合物的一个亚基，与ATG6和ATG14a共定位，部分存在atg8阳性的自噬结构(Wang et al. 2022a, b)，这表明它可能对植物的自噬分析有用。

　　与上述潜在的自噬标志物相比，ATG5-GFP荧光从正常情况下细胞质中的弥漫性信号转变为在营养饥饿期间与ATG8部分共定位的点状和环状细胞质结构，其中一部分定位于生长的吞噬体的边缘(Le Bars et al. 2014)。然而，atg5修饰的吞噬细胞最终会与成熟的自噬体分离，从而阻止它们进入液泡(Le Bars et al. 2014)。这一特性使得ATG5适合用于区分自噬体形成的中间体和成熟自噬体。Bin-Amphiphysin-Rvs结构域蛋白SH3结构域蛋白2 (SH3P2)与ATG6和ATG9共定位，并在自噬诱导过程中转运到吞噬细胞。SH3P2可能在自噬过程中通过与PI3K复合物和ATG8结合，促进膜扩张或成熟，介导自噬(Zhuang et al. 2013)。这些结果表明，与ATG5类似，SH3P2可以作为自噬体形成早期阶段的标记物。因此，协调使用自噬标记物及其中间体，如ATG8、ATG5和SH3P2，融合到荧光蛋白上，可能使我们能够观察自噬从细胞质中的起始到液泡内靶蛋白和细胞器的降解过程。

　　2.2.3 植物自噬的透射电镜观察

　　超微结构分析揭示了拟南芥自噬过程中自噬中间体的一般形态，表明双膜结合自噬体在细胞质中积累是对营养饥饿的反应(Rose et al. 2006)。透射电子显微镜(TEM)是分析自噬过程和自噬结构的一种优秀方法，如吞噬细胞的成核和延伸，闭合形成双膜结合的自噬体，以及自噬体与tono质体融合后，单膜自噬体释放到液泡中(Zhuang et al. 2013;2017;Gao et al. 2015;Zheng et al. 2018)。TEM也是在纳米分辨率下揭示自噬结构形态的唯一工具(Klionsky et al. 2016;Zhou et al. 2023)。

　　在透射电镜下，自噬体明显可见为双膜结合的球状结构，其中含有降解的目标货物。非选择性自噬涉及直径为0.5 ~ 1.5 μm的自噬体(kliossnky et al. 2016;Zheng et al. 2018;图4)，但选择性自噬涉及的自噬结构的大小范围很广，这取决于它们的特定底物。在过去的几年里，透射电镜观察发现，在各种生理条件下，植物中的蛋白质聚集体以及受损的细胞器，如叶绿体(噬绿)、过氧化物酶体(噬绿)、线粒体(噬丝)、内质网(ER-phagy)、核糖体(核糖噬噬)、26S蛋白酶体(蛋白酶噬噬)和病原体都可以通过自噬降解(Ran et al. 2020;Luong et al. 2022)。因此，除了说明自噬结构的形态外，透射电镜还可用于识别降解的自噬体货物。

　　图4

　　

　　拟南芥根细胞自噬体的透射电镜检测。图像显示抗gfp抗体免疫标记的yfp - atg8e阳性结构。YFP-ATG8e转基因幼苗经100 μM BTH处理6 h，然后用抗gfp抗体免疫金标记，其根细胞的代表性TEM图像。箭头表示抗ATG8e抗体的金颗粒(10 nm)。比例尺，100纳米

　　透射电镜与免疫金标记的结合已广泛应用于细胞生物学(Richardson et al. 2022)，通过结合不同大小金颗粒的一抗特异性识别靶分子。使用针对自噬相关蛋白(如SH3P2和ATG8)的抗体的金标免疫透射电镜已被用于标记自噬结构，从而提供自噬体形成的高分辨率空间信息(庄等人，2013;2017;Gao et al. 2015;图4). ATG8免疫金标记也使得检测自噬室内先前未描述的降解细胞器成为可能。应用该技术后，多种功能蛋白在调节植物自噬体形成中发挥重要作用(Zhuang et al. 2013;2017;Gao et al. 2015)。

　　为了利用免疫金-电镜研究SH3P2-GFP阳性区室的超微结构，我们首先对转基因SH3P2-GFP拟南芥植株进行BTH[苯并-(1,2,3)-噻二唑-7-碳硫酸s -甲酯]处理诱导自噬，然后通过高压冷冻/冷冻取代固定样品，随后使用抗sh3p2抗体进行免疫金标记。免疫金电镜观察显示，SH3P2阳性结构的直径在300-1000 nm之间，SH3P2主要定位于膜表面，并通过形成多层腔室参与膜的扩张和成熟。此外，利用抗sh3p2和抗atg8a抗体对转基因SH3P2-GFP植物进行双免疫金标记，确定了SH3P2-GFP标记的多层结构为自噬体或相关结构(Zhuang et al. 2013)。通过免疫金- em研究，植物特异性内体转运所需的内体分选复合物(ESCRT)的组成部分FYVE DOMAIN PROTEIN REQUIRED FOR ENDOSOMAL SORTING 1 (FREE1)被证明在自噬降解中发挥重要作用(Gao et al. 2015)， ATG9被证明在植物细胞中er来源的自噬体形成中至关重要(Zhuang et al. 2017)。

　　虽然传统的透射电镜允许对标记结构进行二维映射，但三维断层扫描重建已被证明可用于分析参与自噬的复杂膜结构。的确，三维电子断层扫描分析显示，吞噬体膜与位于新生自噬体内的粗内质网池相连(Yl?-Anttila et al. 2009)。与此一致，最近一项利用电子断层扫描的研究表明，在拟南芥中，ATG9功能的丧失导致自噬体相关管状结构在自噬诱导下与内质网直接膜连续性的急剧积累(庄等人，2017)。超微结构TEM和三维电子断层扫描分析显示，FREE1参与拟南芥自噬体的关闭(Zeng et al. 2023)。此外，三维断层扫描重建显示，拟南芥中UFM1-SPECIFIC E3 LIGASE 1 (Ufl1)是ufmy化系统的E3连接酶，其功能缺失导致盐胁迫条件下ER吞噬异常，这表明Ufl1在调节ER稳态中发挥作用(Li et al. 2023)。

　　最近，另一项研究采用三维层析成像重建，巧妙地证明了ATG8在植物热胁迫高尔基体恢复中的非规范作用(Zhou et al. 2023)。通过免疫金透射电镜，发现拟南芥氧甾醇结合蛋白相关蛋白2A (ORP2A)与内质网包围的自噬体样结构一起定位(Ye et al. 2022)。三维电子断层扫描分析和三维模型重建表明，ORP2A参与介导er -自噬体膜接触和自噬体生物发生(Ye et al. 2022)。

　　因此，透射电镜是一种非常强大和准确的监测自噬的方法，是在各种复杂环境中以亚细胞分辨率检查自噬的唯一技术。然而，TEM需要专门的设备和专业知识，这对许多实验室来说是一个挑战，而且它不能用于成像活细胞。利用透射电镜结合其他技术来研究自噬的进展变得越来越必要。

　　2.2.4 荧光染料染色

　　虽然GFP-ATG8被认为是自噬结构的理想标记物，但使用GFP-ATG8融合蛋白需要其编码结构在转染原生质体中瞬间表达或在转基因品系中稳定表达。然而，一些嗜酸性荧光染料，如自荧光胺单胺尸胺(MDC)、溶迹红(LTR)、醌和中性红，可用于自噬体或自噬体的染色，使其成为快速和容易染色野生型和突变型植物的标记物，用于自噬体形成的初步分析(Moriyasu and Ohsumi 1996;Munafó和科伦坡2001;Yano et al. 2004;contentto et al. 2005;Liu et al. 2005;Inoue et al. 2006;Patel and Dinesh-Kumar 2008)。由于成熟的自噬体具有酸性腔，它们积累嗜酸性染料。

　　MDC在具有酸性管腔和富脂膜的自噬体等膜腔内积聚，荧光可通过共聚焦或标准荧光显微镜检测(Munafó和Colombo 2001;contentto et al. 2005)。在正常生长条件下，拟南芥悬浮细胞中很少观察到mdc染色的结构。此外，大多数mdc标记的点状结构存在于细胞质中，并与自噬标记物GFP-ATG8e共定位(Contento et al. 2005)。因此，MDC被认为是拟南芥中富含自噬体的标记物，正如在哺乳动物细胞中所显示的那样，它已被广泛应用于研究植物的自噬(Liu et al. 2005,2009;Xiong et al. 2005;Patel and Dinesh-Kumar 2008;Chen et al. 2015;Huang et al. 2019a;Qi et al. 2017)。与其他分析植物自噬的方法相比，MDC提供了一种快速染色拟南芥细胞和整个幼苗的方法，而不需要稳定的转基因植株。

　　LTR是另一种嗜酸荧光染料，通常用于检测动物的自噬体或自溶体(Rodriguez-Enriquez et al. 2006)。近年来，它也被用于观察半胱氨酸蛋白酶抑制剂E-64d处理后烟叶细胞的自溶酶体(Liu et al. 2005;Kwon et al. 2013)。这种染料对中央液泡的染色较弱，但对较小的酸性隔室的染色较强，并且与半胱氨酸蛋白酶抑制剂(如E-64d)联合使用，使自噬体积累更容易观察(Liu et al. 2005;Bassham 2015)。

　　然而，最近的一项研究表明，MDC或LTR染色在某些条件下不适合监测植物的自噬(Merkulova et al. 2014)。在本研究中，在饥饿条件下，拟南芥根系伸长区很少观察到MDC或ltr染色的结构，而在相同条件下生长的GFP-ATG8转基因系中却观察到大量的自噬体。此外，饥饿时根尖上没有GFP-ATG8荧光的MDC或ltr阳性囊泡的共定位(Merkulova et al. 2014)。值得注意的是，这可能是由于本研究中的饥饿处理时间较短(Merkulova et al. 2014)，而传统上研究植物自噬时使用的饥饿时间较长(Yoshimoto et al. 2004;Xiong et al. 2005;Phillips et al. 2008;Suttangkakul et al. 2011;Li et al. 2014;Bassham 2015;Huang et al. 2019b;Qi et al. 2017)。

　　总之，应谨慎使用荧光染料，如MDC和LTR，因为它们倾向于染色自噬体以外的其他酸性区室，并且最好用于初步研究，然后采用替代方法，如GFP-ATG8表达。在得出关于自噬的结论之前，需要进行额外的检测来评估MDC或LTR染色结果。

　　生化方法提供了一种评估真核生物自噬活性的替代方法。ATG蛋白被广泛用于监测植物的自噬活性;这些包括ATG1a, ATG13a和ATG8，其中ATG8使用最广泛(Chung et al. 2010;Suttangkakul et al. 2011;Chen et al. 2015;Qi et al. 2017;2020)。在本节中，我们讨论了使用这些ATG蛋白监测自噬的多种检测方法。

　　2.3.1 ATG蛋白的免疫印迹分析

　　自噬体的形成需要泛素样ATG8与PE结合(Ohsumi 2001;他和Klionsky 2009)。ATG8在翻译后被半胱氨酸蛋白酶ATG4在一个保守的c端甘氨酸残基上切割，从而导致其与PE结合，形成定位于新形成的自噬体内外膜的ATG8 - PE (Ichimura et al. 2000;Chung et al. 2010;Woo et al. 2014)。尽管外膜上的ATG8-PE在自噬体与细胞质融合之前被回收，但内膜上的ATG8-PE与货物一起进入液泡进行降解(Mizushima et al. 2010)。事实上，ATG8-PE的数量通常与atg8阳性点状结构的数量以及自噬活性相关。因此，ATG8-PE加合物已被广泛用作酵母、动物和植物中atg介导的自噬的生化标记物(Rubinsztein et al. 2009;Chung et al. 2010)。拟南芥抗ATG8抗体的商业化可用性使得通过比较拟南芥亚细胞组分中ATG8脂化形式与非脂化形式的比例，可以很容易地确定植物的自噬活性(Chung et al. 2010;Gao et al. 2015;图5)尽管pe共轭形式的ATG8比自由形式的ATG8质量更大，但它在SDS-PAGE凝胶中表现出更快的电泳迁移率，这可能是由于增加了憎水性(Klionsky et al. 2016)。

　　图5

　　

　　通过ATG8脂化分析自噬活性。总蛋白提取物来自于1周大的野生型(WT)幼苗，暴露于氮饥饿(?N)，处理后(hpt)指定小时。总蛋白提取物在6 M尿素存在下进行SDS-PAGE，然后用抗ATG8a抗体进行免疫印迹分析。ATG8 - pe与ATG8的比值显示自噬活性如下图所示。Rubisco在印迹图的下方显示，表示每条车道上装载的蛋白质量

　　值得注意的是，凝胶必须在尿素的存在下运行，通过免疫印迹分析ATG8的脂化和非脂化形式(Klionsky et al. 2016)。此外，与酵母的单拷贝ATG8基因不同，拟南芥和其他植物的基因组含有多个ATG8基因，从而产生了序列和分子质量相似的几种蛋白质(Chung et al. 2010)。因此，针对ATG8a的抗体可以识别大多数ATG8同型异构体，这些异构体在SDS-PAGE上的迁移率存在很大差异，并且它们倾向于识别具有与ATG8 - pe相似的快速迁移率的未知交叉反应物种(Chung et al. 2010)。

　　解决这个问题的有效办法是引入适当的控制措施来区分ATG8和ATG8 - pe。在拟南芥atg5突变体中，ATG8- pe水平严重下降，几乎没有任何ATG8标记的自噬体结构，而非脂化的ATG8大量积累(Chung et al. 2010)。因此，将野生型和atg5突变体幼苗分别作为阳性和阴性对照，通过免疫印迹分析明确鉴定ATG8-PE至关重要。在诱导自噬的条件下，ATG8-PE加合物在atg7-2膜中缺失;然而，它们在野生型和其他几种自噬缺陷突变体中含量丰富，如atg9、atg13a、atg13b双突变体和atg11，这些突变体表现出自噬体向液泡沉积的抑制(Suttangkakul et al. 2011;Li et al. 2014;庄等人，2017)。

　　为了更好地鉴定脂化的ATG8，基于拟南芥中ATG8的膜关联和对磷脂酶D (PLD)的敏感性，设计了一种改进的ATG8脱脂测定方法(Chung et al. 2010)。免疫印迹分析显示，在缺氮幼苗的膜组分中富集的迁移快的物种对PLD孵育敏感，表明迁移快的物种含有PE等磷脂。然而，在野生型幼苗的膜组分中检测到的脂化物质在atg5、atg12a、atg12b和atg10突变体中不存在(Chung et al. 2010)。此外，脂化ATG8物种在PLD消化后转化为非脂化形式的ATG8 (Chung et al. 2010)。因此，通过在免疫印迹之前将蛋白提取物与PLD一起孵育野生型和自噬缺陷突变苗的样品，可以很容易地区分ATG8 - pe加合物和ATG8。

　　ATG1?ATG13复合物是自噬机制的最上游组分之一，通过响应营养状况和控制自噬体的形成，在启动自噬中起着至关重要的作用(Suttangkakul et al. 2011;Li et al. 2014)。值得注意的是，ATG1?ATG13复合物既是自噬的调节因子，也是自噬的靶标，因为它以自噬依赖的方式降解(Suttangkakul et al. 2011)。这一特性使ATG1?ATG13成为检测植物自噬的有用标记物。先前的研究表明，抗ATG1a和抗ATG13a抗体可以检测自噬缺陷突变体(如atg7、atg11和traf1a traf1b双突变体)中ATG1a和ATG13a的积累(Li et al. 2014;Qi et al. 2017)。

　　在植物中，ATG1?ATG13复合物的稳定性或活性受到磷酸化和泛素化等翻译后修饰的严格控制(Qi et al. 2021;Wang and Hou 2022)。例如，环型E3泛素连接酶SINAT家族通过差异调节ATG1?ATG13复合物的泛素化和稳定性来调节自噬(Qi et al. 2020;2022年;2022 b)。植物能量传感器SnRK1和TOR通过调节ATG1?ATG13复合物的磷酸化，分别作为植物自噬的正调节因子和负调节因子。SnRK1激酶的α-亚基SNF1激酶HOMOLOG 10 (KIN10)介导植物在营养饥饿时ATG1a的磷酸化，从而激活自噬体的形成(Chen et al. 2017a)。此外，拟南芥中ATG13的TOR信号(TOS)基序对于TOR磷酸化ATG13非常重要，这表明TOR在ATG13的磷酸化中可能发挥作用(Son et al. 2018)。此外，KIN10在TOR的上游发挥作用，激活自噬，这表明这两种基于磷酸化的植物自噬调节因子之间存在串扰(Soto-Burgos和Bassham 2017)。最近，TYPE ONE PROTEIN PHOSPHATASE (TOPP)被证明在拟南芥营养剥夺过程中介导ATG13a的去磷酸化，并增加对固定碳饥饿的耐受性(Wang et al. 2022a, b)。这些结果表明，ATG1?ATG13复合物的磷酸化状态对植物自噬至关重要。

　　在用抗ATG1a抗体检测的免疫印迹上，检测到ATG1a是一个70 kda的物种，其大小接近野生型植物中69 kda的预测分子质量，并且该物种在自噬缺陷突变体中积累。同时，还检测到与抗atg1a抗体发生交叉反应的蛋白，其分子量大于70 kDa。当与λ磷酸酶孵育时，ATG1a的电泳模式似乎从低迁移率的72-kDa形式转变为高迁移率的70-kDa形式，这表明72-kDa和70-kDa蛋白分别代表了ATG1a的磷酸化和非磷酸化形式(Suttangkakul et al. 2011)。

　　当用抗atg13a抗体检测免疫印迹时，观察到一个由三种，有时是四种物质组成的弥漫性阶梯，表观分子质量从70到80 kDa不等(Suttangkakul et al. 2011)。不同种类的ATG13a不是通过其mRNA的选择性剪接产生的，而是通过单个66-kDa翻译产物的磷酸化产生的。另一条与抗atg13a抗体交叉反应的条带分子量大于80 kDa。λ磷酸酶处理显著降低了80、74和70 kDa的ATG13a物种的水平，并在66 kDa处出现了一个新物种。因此，66-kDa物种可能是ATG13a的非磷酸化形式，而70-80-kDa物种代表不同磷酸化水平的ATG13a (Suttangkakul et al. 2011)。

　　2.3.2 通过检测NBR1蛋白分析植物自噬

　　自噬最初被认为是由许多生物和非生物胁迫诱导的非特异性过程(Bassham 2015)。然而，越来越多的证据表明，自噬也通过选择性地降解特定物质来调节细胞稳态(Stolz et al. 2014)。选择性自噬受体特异性地识别其靶蛋白，并通过与ATG8蛋白结合将其招募到双膜结合的自噬体中进行分解(Stolz et al. 2014)。选择性自噬受体与ATG8之间的特异性相互作用需要选择性自噬受体内保守的ATG8相互作用基序(AIM)和泛素相互作用基序(UIM) (Johansen and Lamark 2011;Marshall et al. 2019)。

　　在植物中发现了一种选择性自噬受体，在拟南芥中称为brca1的邻居(NBR1)，在烟草中称为Joka2;该蛋白是哺乳动物自噬受体NBR1和p62的结构同源和功能杂交(Svenning et al. 2011;Zientara-Rytter et al. 2011)。在选择性自噬过程中，NBR1与其底物蛋白一起进入液泡降解，并在自噬功能丧失突变体中积累(Svenning et al. 2011;Jung et al. 2020;Thirumalaikumar et al. 2021)。为了监测NBR1在拟南芥中的自噬隔离，通过共聚焦显微镜观察NBR1与酸不敏感的mCherry或酸敏感的YFP融合后的荧光定位分化，发现NBR1是一种在液泡中降解的自噬底物(Svenning et al. 2011)。与这一观察结果一致的是，与野生型植物相比，拟南芥atg7突变体的NBR1积累增加(Svenning et al. 2011)。因此，NBR1本身是自噬的底物，在选择性清除过程中随其货物循环，这也在一定程度上反映了植物的自噬通量。

　　2.3.3 裂解GFP-ATG8e分析植物自噬

　　诱导自噬后，ATG8?PE偶联物修饰自噬体的内外膜(Yoshimoto et al. 2004;Woo et al. 2014)。外膜上的ATG8-PE在自噬体与细胞质融合之前被回收，而内膜上的ATG8-PE将进入液泡(Mizushima et al. 2010)。虽然绿色荧光蛋白对酸敏感，在溶酶体(pH为4.5)中降解迅速，但在pH略高的植物液泡中(pH 5.4-5.8)降解较慢(Kaizuka et al. 2016;Liu et al. 2022)。因此，GFP-ATG8不仅通常用于共聚焦显微镜观察自噬体，而且还用于使用抗gfp抗体的生化方法。诱导自噬后，随着GFP- atg8消失，游离GFP在液泡中以时间依赖性的方式积累(图6)，而在自噬缺陷突变体中，这两种变化都被阻断。因此，游离GFP与GFP- atg8的比值反映了自噬通量(Chen et al. 2015;Qi et al. 2017;Huang et al. 2019b)。

　　图6

　　

　　免疫印迹分析显示碳饥饿后GFP-ATG8e融合的处理。在提取蛋白质之前，将1周龄的GFP-ATG8e幼苗转移到不含蔗糖(?C)的MS培养基中。粗提物进行SDS-PAGE和抗gfp抗体免疫印迹分析。右侧为GFP- atg8e和游离GFP。游离GFP与GFP- atg8e的比值如下图所示。考马斯蓝染色的总蛋白如下图所示，作为装载对照。Hpt，治疗后数小时

　　许多核心自噬机制的关键组成部分已经在植物中被确定。然而，确定植物自噬的新参与者对于进一步了解自噬信号网络非常重要。多组学方法，如ATG蛋白相互作用组的遗传和功能分析、全基因组转录组分析和蛋白质组学方法，可能有助于揭示自噬的其他关键成分，并增加我们对相关调控网络的理解。

　　2.4.1 ATG蛋白相互作用组分析植物自噬

　　ATG8不仅是植物自噬体形成的关键成分，而且还参与与多种蛋白靶点的特异性关联，以调节自噬机制对其选择性转换的影响(Marshall and Vierstra 2018)。尽管这些货物蛋白在其他方面表现出较低的序列相似性，但它们含有一个共同的AIM，通常被称为W/YXXL/I/ v样基序，可与ATG8家族蛋白直接结合(Liu et al. 2021)。由于这一特性，ATG8已成为基于蛋白质组学的自噬研究的关键分子。

　　利用拟南芥ATG8f异构体作为诱饵，在酵母双杂交(Y2H)方法中鉴定出多个阳性cDNA克隆，包括两个具有AIM结构域的蛋白，分别命名为ATG8-INTERACTING PROTEIN 1 (ATI1)和ATI2 (Honig et al. 2012)。这两种蛋白参与了种子萌发对外源脱落酸(ABA)处理的反应，表明自噬和ABA信号之间存在潜在联系。

　　最近的一项研究利用基于gfp陷阱的下拉试验和大规模蛋白质组学分析，在营养剥夺的转基因拟南芥植物中寻找与YFP-ATG6和YFP-ATG8相互作用的蛋白质。本研究确定了外壳蛋白复合物II (COPII)机制的两个核心组分，表明ATG机制与植物中特定的COPII组分之间可能存在联系(Zeng et al. 2021)。进一步分析表明，COPII组分Sec23b和Sec23f与ATG6相关，而COPII的另一个组分Sar1d通过非规范基序特异性识别ATG8e以调节自噬体的进展(Zeng et al. 2021)。另一项使用水稻(Oryza sativa) GFP-ATG8a转基因品系进行的基于gfp陷阱的下拉试验也发现了几种在NaCl处理下与atg8a相互作用的蛋白，提供了水稻自噬与盐胁迫耐耐性之间的潜在联系(Liu et al. 2022)。

　　一项以烟草ATG6为诱饵的Y2H研究发现了自噬的其他调节因子。BAX INHIBITOR-1 (BI-1)是一种高度保守的细胞死亡调节剂，与ATG6相互作用，调节植物自噬和程序性细胞死亡(Xu et al. 2017)。微管的主要成分Β-TUBULIN 8被鉴定为ATG6相互作用物，进一步分析表明ATG6与微管共定位。微管的破坏抑制自噬(Wang et al. 2015)。这些结果表明，完整的微管网络对于有效的自噬和叶片淀粉降解至关重要。

　　此外，基于质谱(MS)的分析鉴定甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPCs)是与atg3相互作用的蛋白;GAPCs调节烟叶固有免疫应答过程中的自噬和程序性细胞死亡(Han et al. 2015)。因此，基于质谱的蛋白质组学方法已被证明是确认高阶复合物组装和ATG8与自噬货物受体结合的有力工具。

　　2.4.2 全基因组反式揭示植物自噬功能和调控机制的转录组分析

　　在植物中，ATG基因表达的改变有助于植物进入不同的特定发育阶段，响应各种环境信号，从而促进植物的生长或存活(Yang et al. 2020a)。利用DNA微阵列进行的研究表明，拟南芥自然衰老或黑暗培养的叶片中有几个ATG基因被转录激活(Buchanan-Wollaston et al. 2005;van der Graaff et al. 2006;Breeze et al. 2011)，表明自噬的激活在叶片衰老过程中对营养物质的再动员起作用。利用拟南芥野生型和atg突变体进行的微阵列分析显示，与野生型植物相比，atg突变体中涉及水杨酸和乙烯生物合成的基因被上调，这与atg突变体中发现的这些植物激素水平升高和早期衰老表型一致(Masclaux-Daubresse et al. 2014)。转录组分析还表明，NAC转录因子转录激活因子(ATAF1)参与了碳饥饿诱导的拟南芥衰老过程中ATG基因的表达调控。遗传证据表明，ATAF1的缺失导致拟南芥自噬活性下降，这表明ATAF1可能是整合能量供应与ATG基因表达的关键调节因子(Garapati et al. 2015)。这些结果表明，作为养分循环的关键途径，许多植物ATG基因在营养剥夺和叶片衰老过程中上调，并且很可能受到上游转录因子的调控。

　　全基因组转录组研究也可以帮助研究人员研究自噬在植物生长发育中的功能。RNA-seq分析显示，在玉米种子发育过程中，胚乳中有几个ATG基因被上调(Li et al. 2015)。最近的一项研究证实，在拟南芥的硅酸发育过程中，ATG基因的表达受到强烈诱导，并且ATG突变植物的种子流产率增加，种子储存蛋白在活种子中的沉积也发生了改变(Di et al. 2018)。尽管大量研究表明ATG基因在植物生长发育过程中受到转录调控，但其潜在的分子机制仍有待阐明。

　　越来越多的证据表明，在多种胁迫条件下，ATG基因的表达上调可激活自噬并维持细胞稳态(Yang et al. 2020a, b)。全球转录组分析发现，ATG基因的转录本在植物干燥期更为丰富(Williams et al. 2015;Zhu et al. 2015)。此外，转录组学分析显示，镍处理的莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii，一种单细胞绿藻)中ATG基因表达增加(Pérez-Martín etal . 2015)，表明自噬在植物对重金属的耐受性中发挥了作用。迄今为止，许多转录因子，如WRKY, NAC，热休克因子A1a (HsfA1a)，油菜素抗1 (BZR1)，伸长下胚轴(HY5)， MOTIF-BINDING PROTEIN 9 (TGA9)和乙烯反应因子5 (ERF5)，已被确定参与胁迫应答(Yang等人，2020a, b)。这些转录因子通过结合启动子中的特定顺式元件来诱导或抑制下游ATG基因的基因表达。从而刺激自噬活性，增强植物对生长条件的适应(Yang et al. 2020a, b)。

　　转录谱也为植物自噬的调控机制提供了有价值的见解(Liu et al. 2018)。在拟南芥中，L - CYS DESULFHYDRASE (DES)催化L - CYS的酶促脱硫生成硫化物，des1突变体表现出细胞质中H2S产生减少和脂化ATG8-PE偶联物积累增加(Alvarez等，2012)。在有或没有外源硫化钠(Na2S)的情况下生长的des1突变体的转录谱得出结论，硫化钠抑制自噬(álvarez et al. 2012)。拟南芥的全球转录组分析也证实了TOR激酶作为植物自噬的负调节因子(Caldana et al. 2013)。因此，全基因组转录组分析揭示了植物自噬的基本功能和调控机制，尽管潜在的机制还需要进一步研究。

　　2.4.3 植物自噬的蛋白质组学分析

　　到目前为止，基于质谱(MS)的蛋白质组学已被证明是鉴定应激条件下蛋白质丰度变化的有力工具，可以揭示自噬的调节机制。分析拟南芥野生型和atg突变体蛋白质含量的比较蛋白质组学分析发现，自噬参与植物发育过程中蛋白质降解以及对生物和非生物胁迫的响应(Avin-Wittenberg et al. 2015, Wang et al. 2018;Thirumalaikumar et al. 2021)。此外，越来越多的证据表明，在植物自噬体形成过程中，ATG蛋白的活性和稳定性受到磷酸化、泛素化、脂化、S‐巯基化、S‐亚硝基化和乙酰化等翻译后修饰的强烈影响(Qi et al. 2021)。然而，蛋白质组学在植物自噬中的应用，如ATGs蛋白的翻译后修饰组学尚未见报道。这些方法在揭示植物自噬的其他调节因子方面具有很大的潜力。

　　因此，建立自噬在植物发育和对不同胁迫刺激的反应中的调控网络模型对于我们了解自噬如何通过协调多种组学技术在植物细胞中整合多种环境信号具有重要意义。

　　摘要。

　　1 介绍

　　2 植物自噬研究方法的优缺点

　　3 分析植物自噬的建议

　　4 结论

　　5 植物伦理

　　数据和材料的可用性

　　参考文献。

　　致谢。

　　作者信息

　　道德声明

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