用时间分辨红外光谱法追踪出氧光系统II供体侧的第一个电子转移步骤

　　

　　

　　在进化氧光系统II (PSII)中，从氧化还原活性酪氨酸残基(TyrZ)到叶绿素阳离子自由基(P680+)的多相电子转移先于Mn4Ca簇s态循环的水氧化化学反应。本文利用1310-1890 cm?1光谱范围内的时间分辨单频红外(IR)光谱，研究了这些在激光闪光激发后约10 ns至10 ms内可观察到的早期事件。比较80ns、500ns和10μs的红外光谱差异，可以确定醌、P680和TyrZ的贡献。可分配的P680+宽电子吸收带用于跟踪P680+的还原动力学。P680+瞬态的最小二乘拟合考虑了实验时间分辨率，得到了两个纳秒相(30-46 ns和690-1110 ns)和两个微秒相(4.5-8.3μs和42μs)，它们大部分表现出明显的s态依赖，与其他方法得到的结果一致。我们的研究为进一步了解与TyrZ氧化相关的早期事件及其在为随后的水氧化化学准备PSII供体侧中的作用铺平了道路。

　　光合作用是维持地球上需氧生命的一个基本重要的过程，它通过(a)为生物体提供从光能中获得的化学能，以及(b)产生我们呼吸的氧气。人工光合作用可以通过可持续生产非化石燃料来促进减缓全球气候变化，这也是为什么研究植物、蓝藻和藻类的自然系统是社会感兴趣的众多原因之一(Dau等人，2010;Cox et al. 2015)。光系统II (PSII)是参与含氧光合作用的主要蛋白质复合物之一，是使两个水分子分裂的催化剂，由此从水中去除四个电子和四个质子(后来用于产生化学能载体)，并产生O2作为副产物(Dau和Zaharieva 2009;Vinyard and Brudvig 2017;Junge 2019;Lubitz et al. 2019;Cox et al. 2020;谢维拉等人，2023)。早在20世纪70年代，PSII就已经成为许多研究的主题，其反应周期的主要原理已经确立。

　　光子被吸收后，主要电子给体叶绿素(P680)发生电荷分离，电子转移到邻近的叶绿素分子(Pheo)，从而产生电荷分离对P680?+/Pheo?-(为简单起见，表示基团自由基特征的符号将在下文中省略)。一系列的电子转移步骤(如图1A所示)导致了Mn4CaOx簇的氧化，其与其周围的氨基酸残基和特定的蛋白质内部水分子组成了析氧复合物(OEC)。在一系列的四个吸收事件中，OEC通过所谓的s态循环积累了水分解反应所需的氧化能力(图1B) (Kok et al. 1970)。从暗稳定的S1态(S0到S4，下标表示累积的氧化当量的数量)开始，电子和质子交替被移除，从而保持OEC的总电荷(和氧化还原电位)稳定(Dau和Haumann 2007;Klauss et al. 2012a)。S3→S4跃迁的最终电子移除可能不会像所有其他跃迁那样导致锰的氧化，而是直接导致氧原子的氧化(Greife等人，2023)，但也见(Shevela等人，2023)。

　　图1

　　

　　光系统II的光驱动反应周期。参与电子传递途径的辅助因子。光子的吸收导致初级供体叶绿素上的电荷分离(P680)。电子通过一个叶绿素(Pheo)移动到质体醌QA，再移动到质体醌QB。氧化还原活性酪氨酸残基(表示为TyrZ或YZ)减少P680+，并反过来被Mn4CaOx簇减少，Mn4CaOx簇在四个激发事件的过程中积累氧化等量物。B扩展s态循环图，描绘了Mn4CaOx簇的氧化态(下标)和净电荷态(上标)(S0表示最大还原态)。从暗稳定的S1态开始，连续四次激发闪光导致电子(e?)和质子(H+)交替去除，导致第三次闪光后释放分子氧(O2)。在S2→S3和S3→S0过渡过程中，底物水分子被插入Mn离子的第一配位球中。C菠菜PSII膜粒子在1395 cm?1下5次连续激发闪光的时间分辨红外瞬态。红色表示与S1→S2转换相关的瞬变，蓝色表示S2→S3，绿色表示S3→S0，紫色表示S0→S1。透明线为原始数据;较暗的线条显示了应用平滑算法(滑动平均)后的相同数据。在没有激发闪光的情况下获得的四个瞬态，用黑色表示，说明了噪声水平。t > 0时的数据以对数标度表示，而激发闪光前400ns的红外信号以线性标度表示。(A)和(B)中所示的时间常数是近似的室温值。(A)中的方案和(B)中心的Mn4CaOx簇是使用Umena et al. (2011) (PDB ID: 3wu2)的晶体学数据在PyMOL中绘制的。为简单起见，(A)中一些辅因子的烃尾被省略了

　　在OEC的事件发生之前，有几个重要的电子转移步骤(Dau和Zaharieva 2009)。在PSII的电子受体侧，通过在约300 ps内将电子从Pheo -转移到质体醌分子QA，进一步稳定了电荷分离(Nuijs et al. 1986;Eckert et al. 1988)。电子在QA (QA保持还原状态)上停留0.5到10毫秒，然后转移到第二个质体醌QB上，QB不像QA那样与蛋白质紧密结合。在获得两个电子(来自两个单独的初级电荷分离事件)之后，QB与PSII分离(将电子携带到其他光合作用蛋白)，并被氧化的QB分子所取代。

　　在PSII的电子供体侧，氧化还原活性酪氨酸YZ承担着弥合P680和Mn4CaOx簇之间的缺口的重要任务。大约50年前，YZ还是一个有待解决的谜。Babcock和Sauer(1975)研究了一种名为signal IIfast的EPR信号，后来Styring等人(2012)对其进行了审查，发现该信号起源于YZ。尽管氧化还原伙伴尚未确定，但已经观察到P680+还原动力学是多相和s态依赖的(Gl?ser et al. 1976)。随后的研究证实了这一点，揭示了P680+的还原动力学跨越了四十多年，从几十纳秒到几百微秒(Brettel et al. 1984;Schlodder et al. 1985)。P680+/QA -重组产生了一个与s态无关的200μs慢相(Schlodder et al. 1985;Christen et al. 1998)，导致s态转换不成功。研究发现，在S0和S1状态中，大约20-60纳秒的快速相位比S2和S3状态更为明显，并且一些研究进一步报道了后两种状态的时间常数略慢(Brettel et al. 1984;Meyer et al. 1989;Haumann et al. 1997;Ahlbrink et al. 1998;Jeans et al. 2002)。发现该相的活化能相对较低，约为100 meV (Eckert and Renger 1988)，对H2O/D2O交换几乎没有敏感性(Haumann et al. 1997;Ahlbrink et al. 1998;Schilstra et al. 1998)。它被提出(Eckert and Renger 1988)，后来被更详细地讨论(Christen and Renger 1999;Renger 2004)认为这种快速的纳秒相可能与质子在His190和YZ之间的快速运动有关，但受到电子转移的动力学限制(因此缺乏H/D动力学同位素效应)。

　　大约100-800纳秒的较慢的纳秒相被观察到明显更明显(Eckert和Renger 1988;Meyer et al. 1989;Lukins et al. 1996;Ahlbrink et al. 1998;Schilstra et al. 1998;Jeans et al. 2002)，甚至是独家发现(Brettel et al. 1984;Klauss et al. 2012b)在S2和S3状态下。H2O/D2O交换实验再次显示没有动力学同位素效应(Haumann et al. 1997;Ahlbrink et al. 1998;Schilstra et al. 1998)，但发现活化能(~ 250至300 meV)高于快速纳秒相(Jeans et al. 2002;k

　　等人，2004;Klauss et al. 2012b)。这个缓慢的纳秒阶段被解释为局部“介电”弛豫过程(Renger 2004)，后来也被解释为导致收缩约50 ?3的核重排(Klauss et al. 2012b)。

　　除了与s态无关的200 μs相外，还发现了2个微秒相，分别为1-8 μs和20-40 μs，它们对H2O/D2O交换敏感，其中S2和S3态的贡献最大(Schlodder et al. 1985;Eckert and Renger 1988;Lukins et al. 1996;Christen et al. 1998,1999;Schilstra et al. 1998;Christen and Renger 1999)。微秒动力学被解释为“大尺度质子弛豫”事件(Renger 2004)。在贫锰PSII样品中，纳秒动力学基本不存在，P680+还原动力学以多相微秒相为主(Haumann et al. 1997;Hays et al. 1999)。

　　为了深入了解它们的结构环境，P680和YZ也在非活性PSII样品中进行了FTIR光谱研究(Zhang et al. 1997;Berthomieu et al. 1998;Noguchi et al. 1998)。P680+/P680差异谱证实P680+的自由基阳离子电荷主要集中在一个叶绿素上(Okubo et al. 2007;Nagao et al. 2017)，由于电荷定位会影响氧化还原电位，因此具有重要意义(Takahashi et al. 2008)。P680+/P680差异光谱显示出非常宽的光谱特征，范围约为1000-6000 cm?1，作为一个价间带(Okubo等人，2007;Noguchi 2010)在细菌反应中心(Breton et al. 1992)和光系统I (Breton et al. 1999)中也有类似的特征，这种宽带归因于P680+二聚体性质引起的电子跃迁。

　　最近，FTIR也被广泛应用于完整的PSII样品，以观察s态周期的事件，如(Debus 2015;野口勇2015)。除了一个极其耗时的步进扫描实验(Greife et al. 2023)，这些研究要么是稳态测量，要么是时间分辨率限制在几毫秒。在另一种方法中，单波数的时间分辨红外光谱已被用于观察PSII动力学，代价是光谱覆盖(Noguchi et al. 2012;Takemoto et al. 2019;M?usle et al. 2020)。在每次闪光序列之后，闪光诱导的瞬态表现出明显不同的行为(图1C)，表明与单个s态转变相关的动力学可以很容易地观察到。P680+的还原动力学先前也以微秒时间分辨率在4000 cm?1下观察到(Sakamoto et al. 2017)。通过获取大光谱区域内单个波数的瞬态，我们最近为PSI展示了我们可以在相对较短的测量时间内获得具有良好信噪比(SNR)的时间分辨光谱数据集(M?usle et al. 2023)。

　　我们在此报道了第一次用亚微秒时间分辨率对菠菜中完整的出氧PSII膜颗粒的P680+还原动力学进行红外测量。通过测量仅与宽电子带(> 1760 cm?1)相关的波数的时间分辨红外差分信号，我们可以在没有其他组贡献的情况下观察到P680的事件。在时间分辨光谱数据集的早微秒时间尺度上的双差光谱进一步允许我们在1310-1760 cm?1区域获得P680 Yzox/ P680+ Yz的近似光谱。

　　根据Berthold, Babcock和Yocum (Berthold et al. 1981)制定的协议，如上所述(Schiller和Dau 2000)从菠菜叶中制备PSII膜颗粒。以10 μg Chl, 1 M甜菜碱，25 mM MES, 15 mM NaCl, 5 mM CaCl2 (pH 6.2)缓冲液，1 mM K3[Fe(CN)6]和0.25 mM DCBQ(2,6二氯-1,4-苯醌)为人工电子受体，在28°C下用clark型电极测定其析氧活性(> 1100 μmol O2 / mg叶绿素和h)。样品在- 80℃下保存于1 M甜菜碱，25 mM MES, 15 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 5 mM CaCl2 (pH 6.2)中。在准备红外测量(对应于3mg Chl)时，将样品在冰上解冻一小时，然后在测量缓冲液(与储存缓冲液相同)中重悬，并在50.000×g离心12分钟。丢弃上清，重复同样的重悬-离心洗涤步骤。将人造电子受体PpBQ(苯基-对苯醌，700 mM二甲基亚砜中3 μl)与制备的微球混合。用15 μm PTFE垫片将10 - 12mg的微球挤压在两块CaF2板之间;硅脂用于板的边缘密封。每个测量日，在自动换样台上安装4-5对CaF2板。上述所有步骤均在昏暗的绿光下进行，否则将样品置于黑暗中。

　　红外瞬态是使用先前描述的基于量子级联激光(QCL)的时间分辨单频(TRSFIR)设置测量的(M?usle等人，2020)，该设置已根据其他地方的描述进行了修改(M?usle等人，2023)。QCL (MIRcat-QT-Z-2300, Daylight Solutions, USA)可在1310至1890 cm?1的范围内调谐。采用5ns倍频532 nm Nd-YAG激光器(Minilite II, Continuum，美国)激发，用16位A/D转换器(Spectrum，德国)记录两个10 MHz预放大的碲化汞镉(MCT)探测器(Vigo Systems，波兰)的信号，采样率为65 MS/s。样品室冷却至10°C并用干燥空气冲洗。

　　为了在开始测量之前将PSII膜颗粒同步到相同的s态(S1)，在所有样品点上应用了两次饱和预闪，然后进行了一个小时的暗适应。对于每一个~ 200个单独的样品点，在施加一系列10次1hz的饱和闪光之前，测量适应黑暗的BBY样品的吸光度几秒钟。在每次10闪爆发之后，x - y移动的样品支架移动到一个新的适应黑暗的样品点。所有瞬态都受到热伪影的影响，这是通过以三倍高的激发能量获取第10次闪光红外瞬态，随后计算并减去前面描述的热信号来解释的(M?usle等人，2020)，类似于Sakamoto等人(2017)报道的方法。时间分辨光谱信息是通过沿着QCL范围以2 cm?1的步长在单个波数上依次进行测量而获得的。单个波数的最终瞬态是通过对至少20个瞬态进行平均得到的。最初290波数测量1310和1890厘米?1之间。最终的光谱中只使用了276个波数，其余的由于数据质量差而被省略。由于每个瞬态的平均次数较少，单个瞬态的信噪比总体上受到限制，因此需要沿波数轴应用滑动平均平滑算法(窗口大小为三个数据点)来获得合理平滑的光谱;这导致了大约6-8 cm?1的有效光谱分辨率。

　　将0 ~ 100 μs范围内的瞬态态拟合到由四个指数和定义的模型中，参数化如下:

　　（1）

　　此外，考虑了仪器响应函数(IRF)，该函数在最小二乘优化过程中与多指数模型迭代卷积(Python 3.9.2和lmfit 1.2.2)，详见SI第1节。IRF近似为

　　（2）

　　σ=17 ns (M?usle et al. 2023)， t0=44 ns。所有数据预处理均在Python 3.7中执行。

　　摘要。

　　介绍

　　材料与方法

　　结果

　　讨论

　　数据可用性

　　参考文献。

　　致谢。

　　作者信息

　　道德声明

　　相关的内容

　　# # # # #

　　为了研究s态循环事件发生前的动力学，我们将10个饱和激光序列应用于适应黑暗的PSII膜粒子，在约276个单独的波数范围从1310到1890 cm?1(间距大多为2 cm?1)。在纳秒到800 ms的时间范围内记录了闪致吸收的变化;图1C为示例性高信噪比数据。从这个数据集，可以构造不同的光谱对应于不同的时间后的激光闪烁。在本研究中，我们重点研究了氧化还原活性酪氨酸YZ与P680+快速形成及其还原相关的光谱和反应动力学。在具有完整的出氧配合物的PSII中，后者在激光照射后10μs内基本完成。因此，我们关注的是激光闪光后10μs内发生的事件。

　　图2A显示了激光闪烁后约80 μs(平均50-110 ns)的差谱，图2B显示了约500 μs (250-750 ns)的差谱，图2C显示了约10 μs (8-12 μs)的差谱。图中显示了应用于暗适应PSII的前四次闪光的所有光谱，四次闪光中的每一次都主要启动一个特定的s态转变，从S1→S2开始(参见图1B)。图2所示的光谱与PSII中电荷分离后的事件有关:

　　(A)

　　在激光照射后80 ns，差谱主要反映了P680+和QA?的形成(图2A)。

　　(B)

　　图2B显示了约500 ns时的差谱。此时，P680+还原和YZ氧化的快速纳秒相导致P680+/P680贡献强烈减弱，而与图1A的80 ns光谱相比，QA?/QA差异的幅度可以预期没有减弱。

　　(C)

　　在10μs时，P680+还原基本完成，因此图2C中对应的差谱由YZox/YZ和QA?/QA差谱组成。与80ns光谱相比，QA?/QA的贡献预计不会减少。

　　(D)

　　图2显示了10 μs光谱减去500 ns光谱(C - B)的双差吸光度(ΔΔA)。ΔΔA光谱只对应于P680+还原和YZ氧化，因此代表了YZox/YZ和P680/P680+差谱的总和，没有QA - /QA差谱的贡献。(注意，在A和B中可见的P680+/P680峰在D和E的双差光谱中是倒置的)。

　　(E)

　　图2E显示了与D相同的光谱，但对随时间变化的背景偏移进行了校正，详见补充资料。为了进行基线校正，为四个光谱中的每一个确定一个常数，然后从各自光谱的所有ΔΔA值中减去。此过程对应于平行于x轴的基线的减法。它代表了一种近似的方法，用于提高光谱中正/负峰的可见性和光谱之间s态依赖的差异。

　　图2

　　

　　10℃下菠菜PSII膜颗粒的闪致时间分辨红外差谱。通过获取闪致瞬态，在~ 1310和1890 cm?1之间每隔~ 2 cm?1获得吸光度差(ΔA);应用3个相邻波数的滑动平均值，得到6-8 cm?1的有效光谱分辨率。与S1→S2跃迁(第一次闪过)相关的数据以红色表示，S2→S3跃迁(第二次闪过)为蓝色，S3→S0跃迁(第三次闪过)为绿色，S0→S1(第四次闪过)为洋红色;噪声水平由“暗光谱”(灰色)表示，其获得方式与闪光诱发数据相同，但没有施加激发闪光。前四次激发闪光后的红外光谱差约为80纳秒。光谱是在50 ~ 110 ns范围内取平均值得到的。激发后的红外差谱约为500纳秒(250-750纳秒)。激发后的C - IR差谱在10 μs左右(8-12 μs)。D 10 μs光谱减去500 ns光谱的双差光谱(光谱C -光谱B)。所得的双差吸收(ΔΔA)与A、B和C所示的数据相比较小，因此为了更好地显示(如比例尺所示)，将其乘以3倍。E D所示双差光谱的基线修正版，即10 μs - 500 ns的光谱。非平滑光谱数据(图S3)以及两步基线校正的详细信息可在补充信息中找到

　　在比较图2中光谱的s态依赖关系(闪光数依赖关系)时，我们注意到只有形状上的微小差异，但在早期发现了幅度上的显著差异。在第二和第三闪光光谱中，正峰和负峰的振幅通常比在第一和第四闪光光谱中要大。在1750 cm?1以上可见的宽正特征有效地导致光谱的背景偏移。这种广泛的特征在早期光谱中最为突出(图2A)，随后衰减到较小的贡献，通过直观地比较图2A - c可以很容易地观察到。

　　对比图2A-C, 1362、1418、1440、1456、1478 cm?1处的正峰和1644 cm?1处的负峰的强度随时间没有明显变化，这是醌类化合物的预期行为(见上文)。此外，它们在双差光谱中仅显示微弱或不存在(图2D和E)。因此，我们将这些峰分配给氧化(QA，负峰)或单一还原的醌(QA -，正峰)，与先前的分配一致(Hienerwadel等人，1996;Zhang et al. 1997;Berthomieu et al. 1998;Suzuki et al. 2005)。我们在1328(?)，1572(+)，1658(?)和1718 (+)cm?1附近检测到可能与QA?形成有关的进一步峰。

　　在图2B和C中，1698 cm?1(图2A)处的负峰可能分别降至1696和1692 cm?1，显示出强度随时间的强烈下降。虽然由于基线上移，在视觉上很难检测到，但在1552和1344 cm?1处的负峰表现出类似的衰减行为。然而，这三个特征在基线校正的双差谱中显示出明显的正波段(图2E)，并且类似于先前分配给131-Keto C=O和中性P680氯环振动的峰(Okubo等，2007)。1724 cm?1附近的正信号(图2A)衰减到零附近(图2C)，导致图2E中明显的负峰;在1708 cm?1附近的信号中也观察到类似的行为。这两条条带类似于P680+阳离子的双线特征，这是由于两个主要供体叶绿素之间不均匀的电荷分布造成的(Okubo等人，2007;Nagao et al. 2017)。

　　图2A中位于1638、1648、1688 cm?1处的三个正峰在图2B和C中也表现出强度减弱，导致双差光谱中出现明显的负峰(图2E)。在1680和1658 cm?1处的衰减负峰导致图2E中的正峰。图2B中1734 cm?1的负波段在图2C中上升到1738 cm?1，其行为不太清楚，但在图2E中却产生了一个显著的正峰。上述所有峰在先前报道的P680+/P680光谱中都有对应峰(Nagao et al. 2017)。事实上，图2E中1732 - 1520 cm?1之间的整个区域与P680/P680+光谱的形状非常相似(峰的相对强度有所不同)。

　　如上所述，YZox/YZ特征预计在80ns光谱中大部分不存在，并在以后的时间点变得更加突出。因此，在图2E中，YZox特征应该是正贡献(正峰)，而Yz特征应该是负贡献。比较P680+/P680和YZox/YZ的信号幅度，很明显，YZox/YZ信号的明显程度大约是前者的10倍(Berthomieu et al. 1998;Nagao et al. 2017)。然而，先前在YZox/YZ差谱中的小振幅也可能仅与PSII中相对较小的部分中YZox的形成有关。此前，曾报道过1512和1550 cm - 1处的显著阳性峰以及1543 cm - 1处的负峰(Nakamura et al. 2014;Nagao et al. 2017)，这与图2E的特征不太一致。对于第二和第三次闪光差谱，我们在1520 cm?1处检测到一个正峰，而对于第一和第四次闪光谱，可能存在一个宽(但弱)的峰，大约在1512 cm?1处，可能表明完整OEC的存在改变了之前报道的贫锰PSII中YZox/YZ差谱的光谱特征。

　　图2E光谱区域的特征总体上与P680+/P680差谱相关特征吻合较好。在YZ光谱中，在1677-1700 cm?1附近通常观察到的三重峰在图2E中也不可见。然而，在图2B中，它是隐约可见的:当比较图2B和C时(同时记住基线位移)，1700和1688 cm?1的正峰明显增加，而1680 cm?1的新峰形成-但后者仅在第三闪光光谱中。图2B和C中1550、1542和1532 cm?1处的类导数峰群也类似于先前在YZox/YZ光谱中的发现;但在图2D和E中，这些峰不存在或反转。

　　在贫锰PSII粒子的实验中，在约1700/1706 cm?1(正/负峰)处检测到YZox/YZ差谱的差分信号，并将其归因于P680叶绿素的酮C=O振动的扰动，该振动记为PD1 (Berthomieu et al. 1998;Nakamura et al. 2014;Nagao et al. 2017)。这种1706/1700 cm?1的差分特征在图2C的光谱中也得到了很好的解决(在10μs下收集;P680+种群可忽略不计)，与YZox/YZ的分配一致，并证实了先前报道的贫锰PSII的结果。然而，图2E的双差谱反映了一个更复杂的情况。在图2E中，除了图2C中1700和1706 cm?1处的YZox/YZ特征对1708和1698 cm?1处检测到的峰有贡献外，P680+/P680差谱的特征也很突出。将1708 cm?1和1698 cm?1红外信号与P680+种群(下文将进一步分析)的时间演化进行比较，表明P680+/P680特征对图2E中1708/1698 cm?1峰的贡献更大。此外，80ns光谱中1698 cm?1处的强负峰的存在以及1708/1698 cm?1峰的相对强度支持P680/P680+差谱的主要贡献。我们得出结论，图2E中的双差谱主要由P680/P680+贡献，尽管YZox/YZ特征也有贡献。

　　根据上述结论，我们可以更仔细地观察图2E与以往贫锰、无o2活性PSII样品的FTIR研究中P680+/P680差异光谱的差异。虽然我们在1544 cm?1处看到了一个突出的峰，但在之前的P680+/P680报告中，这个峰只作为一个小的侧峰出现。另一方面，先前报道的1557 cm?1的峰值，在图2E中应该显示为正值，却缺失了。此外，在我们的数据中，1633 cm?1附近的峰值要宽得多，并表现出明显的s态依赖性，清楚地表明OEC(和/或其环境)对这些快速过程的影响。

　　图3显示了前四次激发闪光后的时间分辨红外差分信号，通过在1760-1884 cm?1范围内对51个单独波数的信号进行平均得到。如图2所示，1760 cm?1以上的区域呈现背景(基线)偏移，但没有明显的特征;单个波数的瞬态都显示出相似的动力学(数据未显示)，因此平均以降低噪声水平。图3中的四种闪致瞬态总体上显示出非常相似的动力学。最大信号在第二次和第三次闪光后比第一次和第四次闪光后更高，在大约80ns内出现(达到最大信号的延迟仅仅是由于仪器响应缓慢)。所有四个瞬态都表现出多相衰减回零，从而第一和第四以及第二和第三闪瞬态表现出彼此几乎相同的行为。在100μs左右，任何s态依赖都消失;仅第一次闪光瞬态在~ 100μs到800 Ms的范围内显示出轻微的上移幅度。第五次闪光，以及所有随后的闪光诱发瞬态，没有显示出这种上移信号(图S4)，因此，这归因于目前未知来源的信号贡献，只与应用于黑暗适应PSII的第一次闪光相关。

　　图3

　　

　　在大于1760 cm?1的波数处，闪光灯诱导的红外差吸收对应于图2中可见的宽时间相关背景。在1760和1884 cm?1之间获得的所有瞬态都被平均，以提高信噪比。与S1→S2跃迁(第一次闪过)相关的数据以红色表示，S2→S3跃迁(第二次闪过)为蓝色，S3→S0跃迁(第三次闪过)为绿色，S0→S1(第四次闪过)为洋红色。从激发闪光前100 ns到闪光后11.5 ns的信号用线性标度表示，而从11.5 ns到800 ms的数据用对数x轴表示;两个不同的轴由一条垂直线隔开

　　图4A-C分别显示了图3中数据(及其随后的6次闪烁，如图S4所示)在约80 ns、500 ns和10μs时的平均差分吸收随闪烁次数的函数。图4D还显示了在10μs - 500 ns时的绝对值。所有四个闪光数相关的红外信号都显示出一个清晰的第四纪振荡模式，在第二次闪光时(图4A, B, D)或在第三次闪光时(图4C)达到最大值。

　　图4

　　

　　波数大于1760 cm?1时的平均红外差吸收(ΔA)随激发闪光后不同时间的闪光数的变化。这里的数据对应于图3和图S4的数据集。红外差吸收平均约80纳秒(50-110纳秒)。B红外差吸收平均在500 ns (250 ~ 750 ns)左右。C - IR差吸收平均在10μs左右(8 ~ 12μs)。D从10μs左右的信号中减去500 ns左右的信号(C减去B，乘以?1)得到的绝对红外双差吸收。所有平均红外吸收值(a - D)都与闪烁数有明显的4周期关系。误差条对应于从1760到1884 cm?1之间的所有波数平均信号得到的标准误差

　　1884-1760 cm?1数据的四周期行为，以及与P680+相关的宽电子带在1000至6000 cm?1光谱区域的整个范围内延伸的公认概念(Okubo等人，2007)，提供了一个强有力的迹象，表明图3中的瞬态与完整的、氧气演化的PSII的P680+还原动力学直接相关。P680+背景信号在80 ns、500 ns和10μs(以及10μs - 500 ns)下的闪数依赖性(以及s态依赖性)如图5中的条形图所示。图5中可见的所有趋势都反映了真正的s态依赖，因为它们符合图4各自的振荡模式。乍一看，在80 ns检测到的最大P680+水平的s态依赖性是令人惊讶的，因为每个饱和激光闪光预计会在基本上所有PSII中心诱导P680+形成，这表明相同的初始P680+水平。这里检测到的P680+信号的这种行为可以追溯到我们实验的有限时间分辨率。这可以解释为第一次和第四次闪光的P680+衰减时间比第二次和第三次闪光快，如图6所示的P680+瞬态模拟所示。

　　图5

　　

　　前4次激发闪光后不同时间点> 1760 cm?1处平均红外差吸收(ΔA)的条形图，表示图2中光谱数据的时间和s态相关背景信号。这里显示的数据对应于图3所示的数据集(1760至1884 cm?1之间所有瞬变的平均值)。与S1→S2跃迁(第一次闪过)相关的数据以红色表示，S2→S3跃迁(第二次闪过)为蓝色，S3→S0跃迁(第三次闪过)为绿色，S0→S1(第四次闪过)为洋红色。红外差吸收平均在A 80 ns (50 ~ 110 ns)， B 500 ns (250 ~ 750 ns)， C 10μs(8 ~ 12μs)左右。从10μs左右的信号中减去500 ns左右的信号(C - B，乘以?1)得到的绝对红外双差吸收如图(D)所示。

　　图6

　　

　　用高斯仪器响应函数表示的实验装置的有限时间分辨率对假设的P680+吸收瞬态的最大(峰)强度和峰时间的影响。理想的吸收瞬间形成P680+，并通过单指数衰减完全重新还原P680+，假设衰减时间在1ns到4.1μs之间变化(彩色线)。此外，假设稳定的P680+形成(阶跃函数)用灰色线表示。较细的黑线表示瞬态，其分量介于相邻颜色编码瞬态的速率之间(相邻曲线的衰减时间相差一个因子)。B A中显示的瞬态与先前确定的标准宽度为17 ns(虚线)的高斯仪器响应函数(IRF)卷积(M?usle et al. 2023)。C P680+衰减时间常数对b的卷积瞬态最大振幅(峰值振幅)的影响D P680+衰减时间常数对最大信号振幅时间(tmax)的影响用两个指数分量与高斯红外场卷积模拟吸收瞬态。一个指数被设置为一个非常慢的值，模仿一个阶跃响应，而更快的指数以与a和B相同的方式变化(快速和慢速分量的1:1振幅比)。在C和D中，彩色圆点分别代表B的瞬态。在所有面板中，颜色表示(快速)衰减常数，如图B所示

　　为了进一步表征P680+背景信号，考虑到实验的有限时间分辨率(通过与IRF的卷积，如SI中详细介绍)，图3中的瞬态用四个指数的总和进行了模拟。在0 ~ 100μs的时间范围内，通过最小二乘拟合计算误差和得到的模拟瞬态图及相应的仿真参数分别如图7和图8所示。最慢时间常数在所有四种瞬态中被约束为相同;其他三个时间常数可以自由变化。所有的振幅都可以自由变化，但所有振幅的总和(加上偏移量)在所有瞬态中被限制为相同，通过假设初始P680+信号的幅度在所有s态转换中是相同的来证明。根据图6的说明性模拟，图8的拟合参数表明，图3中瞬态初始峰高的s态依赖性是由于第二次和第三次闪变的最快时间常数比第一次和第四次闪变的最快时间常数慢。

　　图7

　　

　　波数大于1760 cm?1的红外瞬态的多指数拟合，在前四次激发闪光之后。数据(彩色线)与图3对应，但这里用线性时间轴表示激光闪烁前1μs和后5μs的时间。彩色线表示记录的数据，而黑线表示通过与仪器响应函数卷积的多指数P680+衰减的最小二乘拟合得到的模拟，以说明实验的有限时间分辨率。对于图a - d中所示的四个瞬态中的每一个，P680+衰减都是通过四个指数加一个偏移项(y0)的总和来模拟的，同时考虑到仪器的响应函数(参见“材料和方法”一节，了解拟合方法的详细信息)。图8给出了A-D中每个瞬态的拟合结果，即四个振幅(a1至a4)和四个时间常数(τ1至τ4)

　　图8

　　

　　前四个大于1760 cm?1的闪光瞬态的多指数拟合结果(如图7所示)。每个瞬态都被拟合为四个指数和一个偏移量(y0);振幅归一化为所有振幅加上偏移量的总和，因此代表了四个分量对拟合瞬态的相对贡献。振幅和时间常数可以自由变化，只有τ4在所有四个瞬态(拟合范围从0到100μs)中被约束为相同。振幅和y0以条形图表示，并指出了各自的时间常数。由最小二乘拟合程序提供的协方差矩阵得到的振幅的1σ不确定范围用垂直的黑线表示。振幅的绝对值以及偏移量见补充资料图S1和表S2

　　对于所有四种瞬态，快速纳秒时间常数(τ 1,30 - 50 ns)的值以及相应的振幅(S1和S0最高，S2和S3最低)与先前的结果很好地一致(Karge et al. 1996;Schilstra et al. 1998)，除其他外，验证了在瞬态的最小二乘曲线拟合中考虑实验时间分辨率的方法。较慢纳秒分量(τ2)振幅的s态依赖性也与先前关于P680+动力学的发现(在第二次闪光后达到最大值)很好地一致;然而，第四次闪光瞬变(1.1μs)的τ2值比以前报道的值稍慢(Eckert和Renger 1988;Meyer et al. 1989;Lukins et al. 1996;Ahlbrink et al. 1998;Schilstra et al. 1998;Jeans et al. 2002)。两个微秒分量τ3(4-8μs)和τ4(42μs)都与之前关于P680+还原动力学的结果一致，包括时间常数值和振幅的s态依赖(Christen et al. 1998;Schilstra et al. 1998)。综上所述，通过分析红外范围内的吸收变化确定的P680+还原动力学与先前在可见光或近红外(后者约为820 nm)范围内通过光谱学获得的实验结果非常吻合。除了数据收集期间的温度不相同外，模拟参数的差异可能反映了所使用的PSII制剂的变化(特别是不同比例的o2非活性PSII)，或者与存在显著噪声贡献的多指数拟合的细节有关。

　　本文首次在中红外波段对PSII进行了时间分辨研究，研究了激光闪光诱导的[P680+， QA -]自由基对态及其由氧化还原活性酪氨酸(YZ)还原P680+而产生的多相衰变动力学。基于传统的(非时间分辨的)FTIR光谱和复杂的实验方案，之前已经报道了QA - /QA、P680+/P680、YZ+/YZ跃迁的差异光谱，以“分离”可分配给特定氧化还原因子的还原(QA - /QA)或氧化(P680+/P680, YZ+/YZ)的差异光谱(Zhang et al. 1997;Berthomieu et al. 1998;Noguchi et al. 1998;Berthomieu and Hienerwadel 2005;Okubo et al. 2007;Nakamura et al. 2014;Kato et al. 2016;Nagao et al. 2017)。为了检测P680+/P680和YZ+/YZ的差异光谱，采用了典型的贫锰PSII颗粒，其中PSII的供体侧通过去除Mn4CaOx簇而被严重修饰，通常与去除一些膜外源PSII多肽一起。本文报道的时间分辨实验现在可以比较贫锰和完整o2演化PSII之间的P680+/P680和YZ+/YZ差异光谱。

　　总的来说，完整的、o2演化的PSII的双差光谱(图5E)与先前报道的贫锰PSII的P680+/P680光谱(Okubo et al. 2007)表现出极好的一致性，这表明P680和P680+的光谱特征都没有受到Mn4CaOx星团存在的强烈影响。与先前报道的贫锰PSII的YZ+/YZ差谱有明显的相似之处(Nagao et al. 2017)，但也有明显的差异。

　　与贫锰PSII的光谱相比，许多峰明显的s态依赖性提供了新的信息。对于仅与P680/P680+相关的特征，人们可能会期望它们反映在1760 cm?1以上检测到的P680+宽特征的s态依赖性(图5D)，也就是说，与第一闪和第四闪相比，第二闪和第三闪光谱的峰值幅度预计会适度放大。然而，一些峰值(1678(+)、1664(?)、1630(+)和1520(+)cm?1)显示出比预期更明显的振幅s态依赖，而其他峰值(1708(?)、1544(+)、1366(+)、1344(+)cm?1)在噪声级内没有显示出s态依赖。我们假设后者的特征可能只与P680+和YZox的形成间接相关，例如通过远程电场效应。

　　具有强烈s态依赖性振幅的三个特征(1664(?)，1630(+)和1520(+))可能与YZox/YZ有关(以下比较与Nagao等人(2017)报道的光谱有关):

　　(i)

　　在第二次和第三次闪光光谱中，1664 cm?1处的负特征更宽，在第一次和第四次闪光中略有上移。无活性PSII的YZox/YZ光谱在1665(?)和1677(+)处表现出很强的特征，这可能是这种额外调制的原因。

　　(2)

　　1630 cm?1附近的特征在第二和第三闪光光谱中呈现一个小而清晰的双峰，在1612 cm?1处有一个附加的边峰。相比之下，它在第一和第四次闪光中表现为一个广泛的特征。无活性PSII的YZox/YZ光谱在1627 cm?1处显示一个负峰，这可能是我们的数据出现小倾角的原因(使特征出现双峰)。1612 cm?1处的侧峰同样可能是由1620 cm?1附近的倾角引起的，这在非活性PSII的YZox/ YZ光谱中也以负峰的形式存在。

　　(3)

　　第二次和第三次闪光光谱中1520 cm?1处的突出峰在第一次和第四次闪光中被一个较小的宽特征所取代。从非活性PSII的光谱中，我们预计P680/P680+的1520(+)峰和YZox/ YZ的1512(+)峰。第一和第四闪光光谱的宽特征可能是两者的合并峰。可能1512 cm?1的YZox峰值在第二次和第三次闪光中上升，导致一个非常明显的1520 cm?1的峰值。

　　上述讨论的贫锰PSII与YZox/YZ光谱的关系仍然是假设的，特别是由于噪声贡献的可能影响，需要进一步研究。然而，无论光谱细节如何，几个光谱特征的明显s态依赖性表明，在未来的研究中，与YZ氧化相关的s态特异性事件可能是YZ和OEC附近蛋白质-水网络的重排以及酪氨酸残基本身的构象变化，可以通过红外光谱来追踪。

　　迄今为止，光谱的解释是在假设受体侧动力学对早期红外信号没有显著贡献的情况下进行的。实际上，1478 cm?1处的吸收，被分配为半醌模式(Berthomieu et al. 1990)，在校正其P680+背景后，在500 ns至10μs之间基本恒定(图S8A)。这意味着醌的氧化态在这个时间范围内没有变化。然而，仔细观察先前分配给受体侧的其他波数(1658,1638,1552和1532 cm?1;(Berthomieu et al. 1990, Noguchi et al. 1999))表明，它们在上述时间范围内确实表现出变化。即使在没有醌氧化还原状态变化的情况下，这些也可能与受体侧过程有关，例如，反映QA?形成后的离子或蛋白质弛豫过程。例如，负的QA -电荷可能导致PSII受体侧蛋白质-水网络的细微重排，可能涉及质子重排，从而稳定QA -和/或有利于随后的QB还原。确实有报道称，QA还原诱导了非血红素Fe位点的变化，但发现其半衰期相对较慢，约为150μs (Chernev et al. 2011)。下面讨论了在500 ns到10μs的时域内受体侧对红外信号的贡献的可能性。

　　在1658 cm?1处，初始红外吸收变化特别明显(见图2A)。这可能是由于P680+或QA -，两者都吸收在这个波数。然而，在500 ns和10μs之间，1658 cm?1吸收变化的闪数依赖性并没有表现出二周期模式(图S11A)。两个周期模式将强烈支持一个受援方进程的贡献，而四个周期模式则表示供方进程的贡献。

　　QA?、P680+和YZox均吸收1638 cm?1 (Noguchi et al. 1999;Nagao et al. 2017)，这意味着我们预计最初的IR差分信号为正，随着QA -和P680+种群的减少而衰减，但随着YZox的形成而增加。在500 ns和10μs之间，我们确实观察到已经为正的信号在随后衰减之前的上升(未显示);双差吸收的闪数依赖性也不表现为二周期，而是四周期行为(图S11B)。

　　QA?、P680+和YZox也都报道了1532 cm?1左右的阳性带(Noguchi et al. 1999;Nagao et al. 2017)。在此波数下，双差闪烁依赖性可能在较大的四周期模式之上表现出小幅度的二周期行为(图S11D)。

　　总之，在先前分配给醌的四个波数下，图S11的闪光模式分析并没有为受体侧对记录在500 ns至10μs时间范围内的红外信号的贡献提供积极的证据。然而，这一发现并不能排除由QA -形成引起的受体侧贡献(这也可能掩盖与P680+还原或YZ氧化相关的光谱特征)。这是因为由QA氧化诱导的弛豫过程完全独立于QB位点和非血红素Fe位点进行，预计不会表现出二周期闪数依赖性。(在我们的研究中，由于使用PpBQ作为电子受体，一些PSII中的非血红素Fe位点发生了依赖于闪数的氧化态变化;详情见SI。)因此，仍然有一个有趣的选择，即IR瞬态可能报告由QA氧化触发的受体侧过程。今后沿着这条路进行的调查将引起人们的兴趣。

　　通过跟踪时间分辨红外吸收在1800 cm?1左右的波数变化，这是在蛋白质振动区域之外，我们利用广泛的电子P680+波段(跨越大约1000-6000 cm?1)(Okubo et al. 2007)直接观察P680+还原动力学。在1760和1884 cm?1之间的所有瞬态的平均值(图3)显示多相s态依赖行为，与其他光谱研究总体上非常一致(Christen et al. 1998;Schilstra et al. 1998)。以前，P680+的衰变动力学是用可见光或近红外光谱研究的。利用可见光吸收变化，探测光也激发PSII光化学反应;对于近红外探测光(约820 nm)，随时间变化的延迟荧光发射(Buchta et al. 2007;Grabolle and Dau 2007;Zaharieva et al. 2011)由探测器感知。虽然存在解决方法，但当使用时间分辨红外光谱时，没有这些问题可以被视为主要优势。

　　这种多相P680+重组过程以前被解释为引起构象变化，可能涉及质子或水分子的重新定位，使P680+ YZ?P680 YZox平衡更倾向于方程的右侧。例如，在第二次闪光中，P680+还原和YZox形成的最快阶段(约40 ns)仅占P680+信号总振幅的约55%(图8)。50%的值对应于平衡常数为1，因此反应的吉布斯自由能差为零(ΔG0)。在随后的时间常数约为750 ns的过程中，P680+居群显著减少，对应于自由能差的负变化。图8的模拟结果表明，P680+种群的减少至少还有两个过程，每个过程都对应一个越来越负的ΔG0。

　　40 ns相被认为与His190和YZ之间的质子位移有关，或者在此之前(Eckert和Renger 1988);Marcus理论的应用表明，它受到非绝热ET过程的动力学限制(Renger ET al. 1998)。一个可以调和限速电子转移步骤和质子转移的概念是在His190 (D1蛋白)和YZ之间的低势垒氢键(LBHB) (Renger 2004)。PSII的结构分析确实揭示了所讨论的基团的距离比标准氢键的距离短(Saito et al. 2011;Kawashima et al. 2018;Ibrahim et al. 2020;Bhowmick et al. 2023)。

　　缓慢的纳秒相和微秒动力学分别被分配给局部(电介质)和大规模(质子)弛豫过程，这进一步增加了YZ还原P680+的可能性(Renger 2004)。这些步骤也被解释为具有双重作用:(i)稳定YZox，从而减少电荷重组的可能性;(ii)结构变化-包括。重组YZ和Mn4CaOx簇周围的蛋白质-水网络，为随后的反应准备OEC (Klauss et al. 2012b)。Klauss等人还表明，在第二次闪光和第三次闪光中，在较低程度上，缓慢的纳秒级事件伴随着蛋白质的体积变化，强调了结构变化所涉及的观点，这些变化在s态转变之间是不同的。

　　宽电子P680+波段提供了独特的机会，使用中红外光谱来跟踪P680+的形成和衰减在波数窗口(这里1760-1900 cm?1)，在PSII中基本上没有来自分子振动的明显的红外吸收线。因此，通过检测在1760到1900 cm?1范围内的红外吸收变化获得的P680+信号被预测为不受其他氧化还原因子或其他事件(例如改变氢键模式)的重叠贡献。这种振动带的重叠通常在其他光谱区域(波数低于1760 cm?1或远高于1900 cm?1)中观察到，如图2中对光谱的扩展讨论生动地说明了这一点。广泛的、无特征的P680+背景信号之前已被用于通过检测4000 cm?1的红外瞬态来跟踪P680氧化还原状态(Sakamoto et al. 2017)。尽管不同的红外吸收谱线不会对P680+的广泛吸收起作用，但进一步类似的广泛吸收变化可能起作用，如下所述。

　　质子化水团簇或强氢键可以表现出连续的能带，可能会叠加宽的P680+能带(Zundel 1988)。在YZ和D1-His190之间存在这样一个强氢键;在YZ氧化或还原过程中，氢键伴侣和氢键强度发生变化。然而，在1884-1760 cm?1处检测到的瞬态没有显示出任何可分配给Mn4CaOx簇的Yzox还原的时间动力学。因此，我们可以排除YZ-H-His190连续带对P680+信号的任何重要贡献(见图3和图10)。这并不意味着这个和其他连续波段不存在，但它们的振幅很可能明显小于电子P680+波段。(图S10中可见的小幅度信号变化可能与这种连续波段贡献有关。)

　　据报道，与QA和QB相关的宽吸收带在3000至2500 cm?1之间(Suzuki et al. 2005)，可以想象，这些吸收带也延伸到本文研究的波数范围。事实上，在波数高于1760 cm?1的红外瞬变中，毫秒区出现的正信号与QA?和QB?的存在一致(图3);两种醌的作用似乎大致相同(图2)。(9和10)。我们估计它们对初始P680+信号的贡献(对于具有高时间分辨率的检测系统)在第一次闪光应用于适应黑暗的PSII时约为5.5%，在随后的闪光中约为3.5%(图S10)，解释了图8中的y0贡献是由醌贡献(相对于残留的P680+)造成的。我们得出结论，广泛的醌相关吸收很可能是导致P680+红外背景信号的原因。然而，当讨论P680+在时域内从纳秒减少到几十微秒时，它的贡献很小，可能完全可以忽略不计。

　　还有哪些因素影响P680+的宽吸收带及其时间动力学?PSII样品的宽电子带可能是物种依赖的，也可能受到PSII制备类型的影响。Okubo等人(2007)发现，菠菜中的PSII膜和vestitus的核心复合物具有相似但不完全相同的宽带;此外，电子P700+对PSI粒子的广泛吸收也显示出很强的物种依赖性(Hastings等，2001)。P680+动力学在完整PSII和贫锰PSII之间有明显差异(Haumann等，1997;Ahlbrink et al. 1998;Hays et al. 1999)。因此，不同比例的完整PSII和无活性PSII预计也会强烈影响检测到的P680+还原动力学，从而影响背景IR信号。对含有转基因PSII蛋白的脆弱PSII核心复合物的实验可能会受到P680+缓慢重组事件的强烈影响，因为o2非活性PSII的比例特别高。

　　在红外光谱中检测P680+瞬态的好处不应该掩盖与广泛的电子跃迁有关的可能的复杂性。由于电子波段横跨整个中红外区域，预计在中红外区域的所有波数上都会产生主要的时变P680+背景信号。在未来的研究中，校正P680+背景可能是至关重要的，因为它可能会显著影响分配给分子振动的时间过程。近似的校正可以很容易地通过减去在1800 cm?1左右的波数确定的P680+瞬态来实现。这种方法对于与波数无关的电子P680+吸收强度是准确的，但仅近似于弯曲的P680+吸收背景。然而，广泛的P680+吸收的确切波数依赖是未知的，也不容易估计。确定P680的一种方法是用指数函数和对1890至1310 cm?1之间的整个光谱范围内的时间分辨数据集进行全局拟合，其中作为附加的和，在1760 cm?1以上波数处确定的P680+瞬态以仅在整个波数范围内平滑变化的幅度加权，例如，以二次函数的形式。我们注意到，在之前报道的对氧演化PSII的步进扫描FTIR实验中(Greife et al. 2023)，处理步进扫描数据的模式确保了有效的基线校正，因此分配给P680+的广泛电子贡献不会显著影响时间分辨光谱数据集。

　　综上所述，我们建立了一种基于P680+可分配的宽电子吸收带检测的实验方法，用于测定P680+在纳秒到几十毫秒时间范围内的还原动力学。这种吸收带可能导致分子振动的时间分辨数据产生误导，这可以通过适当的修正来避免;提出了一种校正模式。

　　在这里，我们展示了在高时间分辨率下，覆盖扩展光谱范围(1310-1890 cm?1)的析氧PSII光驱动反应的中红外实验。该方法在实验上明显比Greife等人(2023)报道的阶跃扫描FTIR实验更有效。

　　30 - 50ns的快速纳秒分量是当前实验装置时间分辨率的极限。本文所使用的理想多指数拟合函数与IRF的卷积方法虽然提供了合理的结果，但在拟合参数上容易出现明显的不精确。时间分辨率的进一步提高可以提高定量结果的鲁棒性(关于多指数模拟中时间常数和振幅的值)。

　　总之，我们相信本研究为未来在PSII上进行高光谱和时间分辨率的时间分辨红外实验铺平了道路。可以想象，进一步的技术发展将进一步提高实验的性能。

　　以下是电子补充材料的链接。

　　ccDownload: /内容/ pdf / 10.1007 / s11120 - 023 - 01057 - 3. - pdf